Nació en Montpulciano, Italia, en septiembre de 1577, en una familia de la nobleza. Ingresó en la Sociedad de Jesús en 1597, en Nápoles, y después de su formación como sacerdote, tras unos estudios brillantes, embarcó para la misión de la India en 1604, llegando a Goa el 20 de mayo de 1605.
Tras una corta estancia en Cochin, Kerala y la Costa de los Pescadores, fue enviado en 1606 a Madura, capital de la región de Tamil Nadu, para estudiar el idioma. En un año adquirió un completo dominio de tamil, telugu y sánscrito. Fue uno de los primeros europeos en conseguir dominar y comprender en profundidad la literatura y los idiomas con la ayuda de su maestro, Shivadharma.
Di Nobili tradujo al sánscrito o compuso multitud de oraciones y varias obras más largas, especialmente un Compendio de Doctrina Cristiana y una Vida de Nuestra Señora, en verso sánscrito. Su principal obra en tamil es su "Catecismo mayor", en cuatro libros, impreso después de su muerte (parcialmente reimpreso, Trichinopoly 1891-1906), que es un curso de teología adaptado a las necesidades del país. Además escribió un "Tratado de la vida eterna", un "Diálogo de la fe", una "Desaprobación de la transmigración", un "Manual de las reglas de la perfección", numerosos himnos y varias instrucciones aún no editadas, dos pequeños catecismos aún en uso, "La ciencia del alma", y muchas oraciones. Tradujo al Telugu varias de sus obras en tamil, entre ellas los dos pequeños catecismos. En tamil y telugu enriqueció el vocabulario con términos cristianos apropiados. Compuso varias obras apologéticas, catecismos y discursos filosóficos en tamil, y para exponer la doctrina cristiana acuñó varias palabras nuevas, como "kovil" para un lugar de culto, "arul" y "prasadam" para gracia divina, "gurú" para el sacerdote o el maestro, "Vedam" para la Biblia o "poosai" para la misa, entre otras. Casi toda su producción se perdió durante su prisión en Madura (1639-1641).
En su celo de convertir brahmanes adoptó el modo de vida de ellos y así tuvo que cortar cualquier relación con sus compañeros misioneros. Se acercó con entusiasmo a las castas altas y entró en diálogo con diversos estudiosos hindúes acerca de las doctrinas del cristianismo. Pronto se hizo llamar "maestro de sabiduría" y comenzó a vestirse como un sanniasi, los tradicionales monjes peregrinos del hinduismo. También adoptó diversas costumbres locales de la India, como afeitarse la cabeza y mantener sólo un pequeño penacho de pelo. Vestía un dhoti blanco y sandalias de madera, así como con una cuerda trenzada con tres hilos alrededor del pecho, que interpretaba como una representación de la Santísima Trinidad. Su método provocó una feroz controversia entre sus compañeros jesuitas y el arzobispo de Goa, Cristóvão de Sá e Lisboa, sobre los ritos apropiados para los cristianos convertidos. Este procedimiento le hizo ser acusado de idolatría ante el papa por los religiosos menores. La disputa fue clausurada por el papa Gregorio XV con la Constitución Romanæ Sedis Antistes emitida el 31 de enero de 1623. Las costumbres de la cuerda de tres hilos, el penacho, el uso de pasta de sándalo en la frente y los baños al estilo hindú fueron permitidos, siempre que no implicasen ningún ritual supersticioso. El papa invitó también a los neófitos indios a superar su sensibilidad de castas y su desprecio hacia los parias.
Roberto de Nobili trabajó en Madura, Mysore, y el Carnático hasta edad avanzada y la casi completa ceguera que le obligaron a retirarse a Mylapore donde murió, cerca de Chennai, el 16 de enero de 1656, a la edad de 79 años. Sus métodos fueron continuados por san Juan de Brito pocos años después.


